Бактериофаг Т4 относится к крупным фагам Т-четного ряда. ДНК фага Т4 линейная, двухцепочечная, имеет молекулярную массу 120*10 6 , длину 165 тыс. пар оснований., которой достаточно для кодирования примерно 200 генов . Было определено положение на генетической карте почти 100 генов фага (рис. 1) . Для молекул ДНК фага характерна концевая избыточность (длина этих участков составляет несколько процентов от всей длины ДНК, т.е. несколько тысяч пар оснований). Молекулы ДНК фага одинаковы по величине и генетическому составу, но гетерогенны по нуклеотидной последовательности (в результате циклических перестановок генов).

Т4- очень крупный фаг, который имеет достаточно полный и независимый репликативный аппарат. В течение одной минуты после адсорбции фага Т4 синтез молекул хозяина почти полностью прекращается, начинается транскрипция некоторых фаговых генов и через 4 минуты уже идет репликация фаговой ДНК. Инфекция фагом Т4- прекрасная модель для изучения контроля репликации и экспрессии генов .

Репликация ДНК фага Т4 начинается в точке, расположенной между генами 42 и 43 и идет в двух направлениях. Позже возникает много точек репликации, в результате чего образуется до 60 репликативных вилок.

Одно из преимуществ использования фага Т4 как модельной системы для изучения репликации ДНК заключается в том, что все белки, необходимые для элонгации цепи, кодируются фагом. Идентифицированно 11 белков, участвующих в формировании и передвижении репликативной вилки, но только 5 из них необходимы для создания коровой системы . Это продукты генов 43 (Т4 ДНК полимераза), 32 (белок, связывающий одноцепочечную ДНК), 44, 62, 45 (вспомогательные белки). Взаимодействие этих белков определяет точность репликации .

В состав ДНК фага Т4 (и других Т-четных фагов) вместо обычного цитозина. входит необычное основание- оксиметилцитозин (ОМЦ). Большинство остатков ОМЦ глюкозилировано . ДНК с такими модифицированными основаниями не разрезают почти все известные рестриктазы . Ферменты рестрикции E.coli узнают неглюкозилированные остатки ОМЦ в определенных последовательностях, и разрушают такую ДНК. Т-четные фаги не только защищаются от хозяйских рестриктаз, но и кодируют нуклеазы, деградирующие немодифицированную ДНК хозяина, которые не действуюют на фаговую ДНК.

Гликозилирование остатков ОМЦ в ДНК фага Т4 генетически детерминировано, оно происходит путем переноса гликозильных остатков на ДНК в течение нескольких минут после полимеризации с помощью специфических ферментов - гликозилтрансфераз. Такой способ борьбы мог возникнуть только у такого крупного фага, как Т4 .

Вирус сотворили очень давно
О разных формах вируса несущего смерть рассказано в древнем Манускрипте Войнич.

Вирус к 2020 году запрограммирован как эпидемия чумы, от которой нет лекарств.

Но я полагаю, что лекарство есть и оно доступно каждому,
лекарство бесплатно и очень эффективно.

Бактериофаг T4 (англ. Escherichia virus T4, ранее Enterobacteria phage T4) - один из самых изученных вирусов, бактериофаг, поражающий энтеробактерии, в том числе Escherichia coli. Имеет геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов, упакованную в икосаэдрическую головку.

Вирион также имеет ствол, основание ствола и стволовые отростки - шесть длинных и шесть коротких.

Бактериофаг T4 использует ДНК-полимеразу кольцевого типа; его скользящая манжетка является тримером, сходным с PCNA, но она не имеет гомологии ни с PCNA, ни с полимеразой β.

T4 является относительно крупным фагом, имеет диаметр около 90 нм и длину около 200 нм. Фаг T4 использует только литический цикл развития, но не лизогенный.

Английский бактериолог Фредерик Туорт в статье 1915 года описал инфекционную болезнь стафилококков, инфицирующий агент проходил через фильтры, и его можно было переносить от одной колонии к другой.

С фагом Т4 или подобными бактериофагами работали лауреаты Нобелевской премии Макс Дельбрюк, Сальвадор Лурия, Альфред Херши, Джеймс Уотсон и Френсис Крик, а также другие известные ученые - Майкл Россманн, Вадим Месянжинов, Фумио Арисака, Сеймур Бензер, Брюс Альбертс.

Независимо от Фредерика Туорта французско-канадский микробиолог Феликс Д’Эрелль 3 сентября 1917 года сообщил об открытии бактериофагов. Наряду с этим известно, что российский микробиолог Николай Фёдорович Гамалея ещё в 1897 году впервые наблюдал явление лизиса бактерий (сибиреязвенной палочки) под влиянием перевиваемого агента.

В 2016 году, как и другие бактериофаги, был переименован в Escherichia virus T4.

Также Феликс Д’Эрелль выдвинул предположение, что бактериофаги имеют корпускулярную природу. Однако только после изобретения электронного микроскопа удалось увидеть и изучить ультраструктуру фагов. Долгое время представления о морфологии и основных особенностях фагов основывались на результатах изучения фагов Т-группы - Т1, Т2,…, Т7, которые размножаются на Е. coli штамма B. Однако с каждым годом появлялись новые данные, касающиеся морфологии и структуры разнообразных фагов, что обусловило необходимость их морфологической классификации.

Бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную, широко распространённую в биосфере и, предположительно, наиболее эволюционно древнюю группу вирусов. Приблизительный размер популяции фагов составляет более 1030 фаговых частиц.

Строение бактериофагов

Bacteriophage structure.png

1 - головка, 2 - хвост, 3 - нуклеиновая кислота, 4 - капсид, 5 - «воротничок», 6 - белковый чехол хвоста, 7 - фибрилла хвоста, 8 - шипы, 9 - базальная пластинка

Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями. По размеру бактериальные вирусы в сотни и тысячи раз меньше микробных клеток.

Типичная фаговая частица (вирион) состоит из головки и хвоста. Длина хвоста обычно в 2-4 раза больше диаметра головки.

В головке содержится генетический материал - одноцепочечная или двуцепочечная РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окружённая белковой или липопротеиновой оболочкой - капсидом, сохраняющим геном вне клетки.

В природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии. Чем богаче тот или иной субстрат (почва, выделения человека и животных, вода и т. д.) микроорганизмами, тем в большем количестве в нём встречаются соответствующие фаги. Так, фаги, лизирующие клетки всех видов почвенных микроорганизмов, находятся в почвах. Особенно богаты фагами чернозёмы и почвы, в которые вносились органические удобрения.

Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. Бактериофаги могут иметь икосаэдральный капсид, собранный из множества копий одного или двух специфичных белков. Обычно углы состоят из пентамеров белка, а опора каждой стороны из гексамеров того же или сходного белка. Более того, фаги по форме могут быть сферические, лимоновидные или плеоморфные.

Хвост, или отросток, представляет собой белковую трубку - продолжение белковой оболочки головки, в основании хвоста имеется АТФаза, которая регенерирует энергию для инъекции генетического материала. Существуют также бактериофаги с коротким отростком, не имеющие отростка и нитевидные.

Головка округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45-140 нм. Отросток толщиной 10-40 и длиной 100-200 нм. Одни из бактериофагов округлы, другие нитевидны, размером 8×800 нм. Длина нити нуклеиновой кислоты во много раз превышает размер головки, в которой находится в скрученном состоянии, и достигает 60-70 мкм. Отросток имеет вид полой трубки, окружённой чехлом, содержащим сократительные белки, подобные мышечным. У ряда вирусов чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих бактериофагов имеется базальная пластинка, от которой отходят тонкие длинные нити, способствующие прикреплению фага к бактерии. Общее количество белка в частице фага - 50-60 %, нуклеиновых кислот - 40-50 %.

У некоторых фагов в геноме содержится несколько тысяч оснований, тогда как фаг G, самый крупный из секвенированных фагов, содержит 480 000 пар оснований - вдвое больше среднего значения для бактерий, хотя всё же недостаточного количества генов для такого важнейшего бактериального органоида, как рибосомы.

Бактериофаги выполняют роль в контроле численности микробных популяций, в автолизе стареющих клеток, в переносе бактериальных генов, выступая в качестве векторных «систем».

Действительно, бактериофаги представляют собой один из основных подвижных генетических элементов. Посредством трансдукции они привносят в бактериальный геном новые гены. Было подсчитано, что за 1 секунду могут быть инфицированы 1024 бактерий. Это означает, что постоянный перенос генетического материала распределяется между бактериями, обитающими в сходных условиях.

Высокий уровень специализации, долгосрочное существование, способность быстро репродуцироваться в соответствующем хозяине способствует их сохранению в динамичном балансе среди широкого разнообразия видов бактерий в любой природной экосистеме.

Когда подходящий хозяин отсутствует, многие фаги могут сохранять способность к инфицированию на протяжении десятилетий, если не будут уничтожены экстремальными веществами либо условиями внешней среды.

Крупные фаги Т2 и Т4 близкородственны. Они обладают идентичной организацией генома, и большинство генов у них общие. Радиоавтография хромосомы фага Т4 (рис. 7.13) свидетельствует о линейности молекулы ДНК. Ее мол. масса равна 120-10 6 дальтон, а длина составляет 182 000 пары нуклеотидов. Фаг Т4 был предметом интенсивных генети-

214

ческих исследований (вспомните rII -мутанты из гл. 6), и для него известны мутации во многих цистронах. Анализ рекомбинации с использованием трех- и четырехфакторных скрещиваний показал, что генетическая карта фага Т4 имеет кольцевую форму (рис. 7.14). Противоречие между линейностью молекулы ДНК фага и кольцевой формой его генетической карты удалось разрешить в результате генетических и физических экспериментов, показавших, что выделенные из фага Т2 линейные молекулы ДНК содержат на обоих концах участки с одинаковыми последовательностями нуклеотидов (концевую избыточность), а порядок генов в молекуле допускает циклические перестановки. Физические данные о концевой избыточности (дуплицированности) последовательностей оснований получены из экспериментов, в которых ДНК Т2 подвергалась действию экзонуклеазы III. Этот фермент последовательно отщепляет нуклеотиды с 3-ОН-концов цепей ДНК, в результате чего на концах двухцепочечной молекулы образуются одноцепочечные участки с 5"-РО 4 -концами (рис. 7.15). Инкубация этих подвергнутых действию фермента молекул в условиях, допускающих установление водородных связей между комплементарными одноцепочечными последовательно-

7. Геном вируса 215

стями, приводит к образованию кольцевых молекул (рис. 7.16). Замыкание в кольцо возможно лишь в том случае, если двухцепочечная молекула ДНК фага Т2 содержит идентичные последовательности оснований на обоих концах, как это схематически изображено на рис. 7.15. Прежде чем молекулы становятся способны образовывать кольца, фермент должен отщепить около 2% ДНК Т2. Это означает, что протяженность дуплицированных (избыточных) концов молекулы составляет около 1% длины генома. Генетические данные о концевой избыточности геномов фагов Т2 и Т4 проистекают из существования гетерозиготных фаговых частиц. Фаговые гетерозиготы возникают в результате рекомбинации между фагами с различными генотипами. Они легко идентифицируются, поскольку каждый такой фаг образует негативную колонию, содержащую фаги обоих генотипов (см. рис. 6.1). Геном единичного фага может быть

216Организация и передача генетического материала

гетерозиготным лишь по тесно сцепленным генам. В популяции фагов, однако, встречаются гетерозиготы по всем генам, безотносительно к их положению на карте. Кроме того, размер участка, по которому фаг избыточен и гетерозиготен, увеличивается у мутантов, несущих делеции, в связи с особым механизмом упаковки, который мы вкратце рассмотрим ниже. (В отличие от фага λ у фагов Т2 и Т4 делеции не уменьшают количество ДНК в головке фага.) Из этих наблюдений можно сделать лишь один логический вывод: не существует единственного уникального порядка генов вдоль всей молекулы ДНК, другими словами, у конкретных фагов в популяции избыточным может быть любой ген.

7. Геном вируса 217

Следующий эксперимент подтверждает это поразительное заключение. Препарат ДНК фага Т2 денатурировали нагреванием, для того чтобы разделить комплементарные цепи каждой молекулы. Смесь одиночных цепей выдерживали затем в условиях, допускающих восстановление водородных связей между комплементарными последовательностями оснований. Большинство одиночных цепей в смеси оказалось способно восстановить двухцепочечную структуру с партнером, исходнопринадлежавшим другой нативной молекуле ДНК (рис. 7.17). При электронно-микроскопическом анализе такой смеси обнаруживается много кольцевых двухцепочечных молекул (рис. 7.18). Образование двухцепочечных структур возможно лишь в том случае, если исходный препарат ДНК содержит такую популяцию молекул, в которой последовательность генов в любой молекуле можно получить посредством циклической перестановки (пермутации) генов в любой другой молекуле. Именно циклические перестановки и концевая избыточность индивидуальных молекул ДНК фагов Т2 и Т4 обусловливают кольцевую структуру их генетической карты, отражая отношения сцепления между генами в популяции индивидуальных молекул.

218 Организация и передача генетического материала

Специальный способ репликации ДНК и упаковки дочерних молекул ДНК в головки фагов Т2 и Т4 обеспечивает возможность получения от единичных фаговых частиц потомства с циклической перестановкойи концевой избыточностью. На ранних стадиях инфекции линейная родительская молекула ДНК претерпевает несколько последовательных репликаций, образуя такие же линейные дочерние молекулы, содержащие весь геном фага плюс концевую избыточность. Затем в результате рекомбинации между избыточными концами дочерних молекул образуются конкатемеры (тандемно повторяющиеся последовательности геномов фага (рис. 7.19), которые затем реплицируются и рекомбинируют, образуя еще более длинные конкатемеры. На заключительной стадии инфекции молекулы ДНК начинают упаковываться в головки (капсиды) фагов (вспомните рис. 7.2). Размер молекулы ДНК, помещае-

7. Геном вируса 219

мой в капсид каждого фага, определяется размером самого капсида. Капсид вмещает чуть больше ДНК, чем ее содержится в геноме фага Т4, как раз настолько, чтобы осталось место для избыточных участков на концах генома. Такой механизм упаковки ДНК посредством отрезания от длинного конкатемера кусков, по длине несколько превышающих протяженность генома фага, приводит к циклической перестановке (пермутации) последовательности генов в отдельных дочерних фагах,

220Организация и передача генетического материала

как это схематически показано на рис. 7.19. Тот же самый механизм инкапсулирования геномов фага Т4 приводит к возникновению гетерозигот с избыточными концами в двукратно инфицированных клетках (рис. 7.19). Такой тип организации генома встречается не только у бактериофагов. Он обнаружен также, например, у так называемого «вируса 3 лягушки» - вируса, способного инфицировать клетки многих видов позвоночных, в том числе и человека, при температуре ниже 32°С.

7. Геном вируса 221

На генетической карте фага Т4 (рис. 7.20) видно, что вместе сгруппированы гены, ответственные за родственные физиологические функции. Такая же организация генома уже встречалась нам у фага λ. Этот тип организации функционирования генома играет важную роль в ее регуляции (гл. 15).

222Организация и передача генетического материала